Transfer DNA Binärsystem - Transfer DNA binary system
Ein Transfer - DNA ( T-DNA ) binäres System ist ein Paar von Plasmiden , die aus einem T-DNA - Vektor - binary und einem vir - Helferplasmid . Die beiden Plasmide werden zusammen (also binär ) verwendet, um gentechnisch veränderte Pflanzen zu produzieren . Sie sind künstliche Vektoren , die von dem natürlich vorkommenden Ti-Plasmid abgeleitet wurden, das in Bakterienarten der Gattung Agrobacterium wie A. tumefaciens gefunden wurde . Der binäre Vektor ist ein Shuttle-Vektor , der so genannt wird, weil er sich in mehreren Wirten (z. B. Escherichia coli und Agrobacterium ) replizieren kann .
Systeme, in denen sich T-DNA- und Vir- Gene auf getrennten Replikons befinden, werden als T-DNA-Binärsysteme bezeichnet. T-DNA befindet sich auf dem binären Vektor (der Nicht-T-DNA-Region dieses Vektors, die Replikationsursprünge enthält, die sowohl in E. coli als auch in Agrobacterium funktionieren könnten , sowie auf Antibiotikaresistenzgenen , die zur Selektion auf das Vorhandensein von verwendet werden binärer Vektor in Bakterien, bekannt als Vektor-Backbone-Sequenzen). Das Replikon, das die vir- Gene enthielt , wurde als vir- Helferplasmid bekannt. Das vir- Helferplasmid gilt als entwaffnet, wenn es keine Onkogene enthält, die auf eine Pflanze übertragen werden könnten.
Binäre Systemkomponenten
T-DNA-Binärvektor
Es gibt mehrere binäre Vektoren, die sich in Agrobacterium replizieren und zur Abgabe von T-DNA aus Agrobacterium in Pflanzenzellen verwendet werden können. Der T-DNA-Teil des binären Vektors wird von Sequenzen der linken und rechten Grenze flankiert und kann ein Transgen sowie einen pflanzenselektierbaren Marker enthalten . Außerhalb der T-DNA enthält der binäre Vektor auch einen bakteriell selektierbaren Marker und einen Replikationsursprung (ori) für Bakterien.
Repräsentative Reihen von Binärvektoren sind unten aufgeführt.
| Serie | Vektor | Jahr | GenBank-Beitritt | Größe (bp) | Autonome Replikation in Agrobacterium | Referenz |
|---|---|---|---|---|---|---|
| pBIN | pBIN19 | 1984 | U09365 | 11777 | Ja | |
| pPVP | pPZP200 | 1994 | U10460 | 6741 | Ja | |
| pCB | pCB301 | 1999 | AF139061 | 3574 | Ja | |
| pCAMBIA | pCAMBIA-1300 | 2000 | AF234296 | 8958 | Ja | |
| pGrün | pGreen0000 | 2000 | AJ007829 | 3228 | Nein | |
| pLSU | pLSU-1 | 2012 | HQ608521 | 4566 | Ja | |
| pLX | pLX-B2 | 2017 | KY825137 | 3287 | Ja |
Vir- Helferplasmid
Das vir- Helferplasmid enthält die vir- Gene, die aus dem Ti-Plasmid von Agrobacterium stammen . Diese Gene kodieren für eine Reihe von Proteinen, die den binären Vektor an der linken und rechten Randsequenz schneiden und den Transfer und die Integration von T-DNA in die Zellen bzw. Genome der Pflanze erleichtern.
Es wurde über mehrere Vir- Helfer-Plasmide berichtet, und übliche Agrobacterium- Stämme, die Vir- Helfer-Plasmide enthalten, sind:
- EHA101
- EHA105
- AGL-1
- LBA4404
- GV2260
Entwicklung von T-DNA-Binärvektoren
Der pBIN19-Vektor wurde in den 1980er Jahren entwickelt und ist einer der ersten und am häufigsten verwendeten binären Vektoren. Der pGreen-Vektor, der im Jahr 2000 entwickelt wurde, ist eine neuere Version des binären Vektors, die eine Auswahl von Promotoren, selektierbaren Markern und Reportergenen ermöglicht. Ein weiteres Unterscheidungsmerkmal von pGreen ist die starke Verringerung der Größe (von etwa 11,7 kbp auf 4,6 kbp) gegenüber pBIN19, wodurch die Transformationseffizienz erhöht wird .
Neben einer höheren Transformationseffizienz wurde pGreen entwickelt, um die Integrität der Transformation sicherzustellen. Sowohl pBIN19 als auch pGreen verwenden normalerweise denselben auswählbaren Marker nptII , aber pBIN19 hat den auswählbaren Marker neben dem rechten Rand, während pGreen ihn nahe am linken Rand hat. Aufgrund eines Polaritätsunterschieds am linken und rechten Rand tritt der rechte Rand der T-DNA zuerst in die Wirtspflanze ein. Befindet sich der selektierbare Hersteller nahe der rechten Grenze (wie dies bei pBIN19 der Fall ist) und wird der Transformationsprozess unterbrochen, kann die resultierende Pflanze einen selektierbaren Marker exprimieren, enthält jedoch keine T-DNA, die ein falsches Positiv ergibt. Der pGreen-Vektor hat den auswählbaren Marker, der zuletzt in den Wirt eintritt (aufgrund seiner Position neben dem linken Rand), so dass jede Expression des Markers zu einer vollständigen Transgenintegration führt.
Die pGreen-basierten Vektoren sind nicht autonom und replizieren nicht in Agrobacterium, wenn pSoup nicht vorhanden ist. Eine Reihe kleiner binärer Vektoren, die sich autonom in E. coli und Agrobacterium replizieren, umfassen:
- pCB
- pLSU
- pLX