Hochdurchsatz-Screening - High-throughput screening

Hochdurchsatz-Screening-Roboter

High-Throughput-Screening ( HTS ) ist eine Methode für wissenschaftliche Experimente, die insbesondere in der Wirkstoffforschung eingesetzt wird und für die Bereiche Biologie und Chemie relevant ist . Mithilfe von Robotik , Datenverarbeitungs-/Steuerungssoftware, Liquid-Handling-Geräten und empfindlichen Detektoren ermöglicht das Hochdurchsatz-Screening einem Forscher die schnelle Durchführung von Millionen chemischer, genetischer oder pharmakologischer Tests. Durch diesen Prozess kann man schnell Wirkstoffe, Antikörper oder Gene identifizieren, die einen bestimmten biomolekularen Stoffwechselweg modulieren. Die Ergebnisse dieser Experimente bieten Ansatzpunkte für das Arzneimitteldesign und für das Verständnis der Nichtinteraktion oder Rolle eines bestimmten Ortes.

Vorbereitung der Testplatte

Ein Roboterarm handhabt eine Assay-Platte

Das wichtigste Laborgerät oder Testgefäß von HTS ist die Mikrotiterplatte : ein kleiner Behälter, normalerweise Einwegartikel aus Kunststoff, der ein Gitter aus kleinen, offenen Vertiefungen aufweist, die als Wells bezeichnet werden . Im Allgemeinen haben Mikrotiterplatten für HTS entweder 96, 192, 384, 1536, 3456 oder 6144 Wells. Dies sind alles Vielfache von 96 und spiegeln die ursprüngliche 96-Well-Mikrotiterplatte mit beabstandeten Wells von 8 x 12 mit einem Abstand von 9 mm wider. Die meisten Wells enthalten Testgegenstände, abhängig von der Art des Experiments. Dies können verschiedene chemische Verbindungen sein, die zB in einer wässrigen Lösung von Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst sind . Die Vertiefungen könnten auch Zellen oder Enzyme irgendeines Typs enthalten. (Die anderen Wells können leer sein oder reine Lösungsmittel oder unbehandelte Proben enthalten, die als experimentelle Kontrollen verwendet werden sollen .)

Eine Screening-Einrichtung verfügt normalerweise über eine Bibliothek mit Stammplatten , deren Inhalt sorgfältig katalogisiert ist und von denen jede möglicherweise vom Labor erstellt oder von einer kommerziellen Quelle bezogen wurde. Diese Vorratsplatten selbst werden nicht direkt in Experimenten verwendet; stattdessen werden nach Bedarf separate Assayplatten erstellt. Eine Assay-Platte ist einfach eine Kopie einer Stammplatte , die durch Pipettieren einer kleinen Menge Flüssigkeit (oft in Nanolitern gemessen ) aus den Wells einer Stammplatte in die entsprechenden Wells einer vollständig leeren Platte hergestellt wird.

Reaktionsbeobachtung

Zur Vorbereitung eines Assays füllt der Forscher jede Vertiefung der Platte mit einer biologischen Einheit, an der er das Experiment durchführen möchte, wie beispielsweise einem Protein , Zellen oder einem tierischen Embryo . Nachdem eine gewisse Inkubationszeit verstrichen ist, damit das biologische Material die Verbindungen in den Vertiefungen absorbieren, daran binden oder auf andere Weise mit ihnen reagieren (oder nicht reagieren) kann, werden Messungen über alle Vertiefungen der Platte entweder manuell oder durch eine Maschine durchgeführt. Manuelle Messungen sind oft erforderlich, wenn der Forscher die Mikroskopie verwendet, um (zum Beispiel) Veränderungen oder Defekte in der Embryonalentwicklung zu suchen, die durch die Verbindungen der Vertiefungen verursacht werden, und nach Effekten suchen, die ein Computer nicht leicht selbst bestimmen könnte. Andernfalls kann ein spezialisierter Analyseautomat eine Reihe von Experimenten an den Wells durchführen (z. B. das Bestrahlen mit polarisiertem Licht und das Messen des Reflexionsvermögens, das ein Hinweis auf die Proteinbindung sein kann). In diesem Fall gibt das Gerät das Ergebnis jedes Experiments als ein Raster numerischer Werte aus, wobei jede Zahl dem aus einer einzelnen Vertiefung erhaltenen Wert zugeordnet wird. Ein Analysegerät mit hoher Kapazität kann auf diese Weise innerhalb weniger Minuten Dutzende von Platten vermessen und sehr schnell Tausende von experimentellen Datenpunkten erzeugen.

Abhängig von den Ergebnissen dieses ersten Assays kann der Forscher Folgeassays innerhalb desselben Screens durchführen, indem er Flüssigkeit aus den Quell-Wells, die interessante Ergebnisse lieferte (bekannt als „Treffer“), in neue Assay-Platten „herd pickt“ und dann erneut durchführt das Experiment, um weitere Daten zu dieser eingeschränkten Menge zu sammeln, um die Beobachtungen zu bestätigen und zu verfeinern.

Automatisierungssysteme

Ein Karussellsystem zum Aufbewahren von Assayplatten für hohe Lagerkapazität und schnellen Zugriff

Automatisierung ist ein wichtiges Element für die Nützlichkeit von HTS. Typischerweise transportiert ein integriertes Robotersystem , das aus einem oder mehreren Robotern besteht, Assay-Mikroplatten von Station zu Station zur Proben- und Reagenzzugabe, zum Mischen, zur Inkubation und schließlich zum Auslesen oder Nachweisen. Ein HTS-System kann normalerweise viele Platten gleichzeitig vorbereiten, inkubieren und analysieren, was den Datenerfassungsprozess weiter beschleunigt. Derzeit gibt es HTS-Roboter, die bis zu 100.000 Verbindungen pro Tag testen können. Automatische Koloniepicker pflücken Tausende von mikrobiellen Kolonien für ein genetisches Screening mit hohem Durchsatz. Der Begriff uHTS oder Ultra-High-Throughput-Screening bezieht sich (ca. 2008) auf das Screening von mehr als 100.000 Verbindungen pro Tag.

Experimentelles Design und Datenanalyse

Mit der Fähigkeit des schnellen Screenings verschiedener Verbindungen (wie kleine Moleküle oder siRNAs ) zur Identifizierung von Wirkstoffen hat HTS in den letzten Jahren zu einer explosionsartigen Zunahme der Datenmenge geführt. Folglich besteht eine der grundlegendsten Herausforderungen bei HTS-Experimenten darin, biochemische Bedeutung aus Datenbergen zu gewinnen, was auf der Entwicklung und Einführung geeigneter experimenteller Designs und analytischer Methoden sowohl für die Qualitätskontrolle als auch für die Trefferauswahl beruht . Die HTS-Forschung ist eines der Gebiete, die ein Merkmal aufweisen, das von John Blume, Chief Science Officer für Applied Proteomics, Inc., wie folgt beschrieben wird: Wenn ein Wissenschaftler einige Statistiken oder rudimentäre Datenverarbeitungstechnologien nicht versteht, kann er oder sie bald nicht als echter Molekularbiologe angesehen werden und daher einfach "ein Dinosaurier" werden.

Qualitätskontrolle

Hochwertige HTS-Assays sind bei HTS-Experimenten von entscheidender Bedeutung. Die Entwicklung hochwertiger HTS-Assays erfordert die Integration sowohl experimenteller als auch computergestützter Ansätze zur Qualitätskontrolle (QC). Drei wichtige Mittel der QC sind (i) ein gutes Plattendesign, (ii) die Auswahl wirksamer positiver und negativer chemischer/biologischer Kontrollen und (iii) die Entwicklung effektiver QC-Metriken zur Messung des Differenzierungsgrads, so dass Assays mit minderwertigen Daten Qualität erkannt werden kann. Ein gutes Plattendesign hilft dabei, systematische Fehler (insbesondere solche, die mit der Bohrlochposition verbunden sind) zu identifizieren und zu bestimmen, welche Normalisierung verwendet werden sollte, um die Auswirkungen systematischer Fehler auf die Qualitätskontrolle und die Trefferauswahl zu beseitigen/zu reduzieren.

Effektive analytische QC-Methoden dienen als Gatekeeper für Assays von ausgezeichneter Qualität. In einem typischen HTS-Experiment ist eine klare Unterscheidung zwischen einer Positivkontrolle und einer Negativreferenz wie einer Negativkontrolle ein Indiz für gute Qualität. Es wurden viele Maßnahmen zur Qualitätsbewertung vorgeschlagen, um den Grad der Differenzierung zwischen einer positiven Kontrolle und einer negativen Referenz zu messen. Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis, Signal-zu-Rausch-Verhältnis, Signalfenster, Assay-Variabilitätsverhältnis und Z-Faktor wurden verwendet, um die Datenqualität zu bewerten. Für die Bewertung der Datenqualität in HTS-Assays wurde kürzlich eine streng standardisierte Mittelwertdifferenz ( SSMD ) vorgeschlagen.

Trefferauswahl

Eine Verbindung mit einer gewünschten Effektgröße in einem HTS wird als Hit bezeichnet. Das Auswählen von Treffern wird als Trefferauswahl bezeichnet. Die Analysemethoden zur Trefferselektion in Screens ohne Replikate (meist in Primärscreens) unterscheiden sich von denen mit Replikaten (meist in Bestätigungsscreens). Beispielsweise eignet sich die Z-Score-Methode für Bildschirme ohne Replikate, während die t-Statistik für Bildschirme mit Replikaten geeignet ist. Auch die Berechnung von SSMD für Bildschirme ohne Replikate unterscheidet sich von denen für Bildschirme mit Replikaten.

Für die Trefferselektion in primären Screens ohne Replikate sind die leicht interpretierbaren die durchschnittliche Faltungsänderung, die mittlere Differenz, die prozentuale Hemmung und die prozentuale Aktivität. Sie erfassen jedoch die Datenvariabilität nicht effektiv. Die Z-Score-Methode oder SSMD, die Datenvariabilität basierend auf der Annahme erfassen kann, dass jede Verbindung dieselbe Variabilität wie eine negative Referenz in den Bildschirmen aufweist. Bei HTS-Experimenten treten jedoch häufig Ausreißer auf, und Methoden wie der Z-Score reagieren empfindlich auf Ausreißer und können problematisch sein. Als Konsequenz wurden robuste Verfahren wie das z*-Score-Verfahren, SSMD*, das B-Score-Verfahren und das auf Quantilen basierende Verfahren vorgeschlagen und für die Trefferauswahl übernommen.

In einem Screen mit Replikaten können wir die Variabilität für jede Verbindung direkt abschätzen; Als Konsequenz sollten wir SSMD oder t-Statistiken verwenden, die nicht auf der starken Annahme beruhen, auf der sich der Z-Score und der Z*-Score stützen. Ein Problem bei der Verwendung von t-Statistiken und zugehörigen p-Werten besteht darin, dass sie sowohl von der Stichprobengröße als auch von der Effektgröße beeinflusst werden. Sie stammen aus Tests auf keinen mittleren Unterschied und sind daher nicht darauf ausgelegt, die Größe der zusammengesetzten Effekte zu messen. Bei der Trefferauswahl ist das Hauptinteresse die Größe des Effekts in einer getesteten Verbindung. SSMD bewertet direkt die Größe der Effekte. SSMD hat sich auch als besser als andere häufig verwendete Effektstärken erwiesen. Der Populationswert von SSMD ist in allen Experimenten vergleichbar und daher können wir denselben Cutoff für den Populationswert von SSMD verwenden, um die Größe der zusammengesetzten Effekte zu messen .

Techniken für mehr Durchsatz und Effizienz

Einzigartige Verteilungen von Verbindungen über eine oder viele Platten können verwendet werden, um entweder die Anzahl der Assays pro Platte zu erhöhen oder die Varianz der Assay-Ergebnisse zu verringern oder beides. Die bei diesem Ansatz gemachte vereinfachende Annahme besteht darin, dass irgendwelche N-Verbindungen in derselben Vertiefung typischerweise nicht miteinander oder mit dem Assay-Ziel in einer Weise wechselwirken, die die Fähigkeit des Assays, echte Treffer zu erkennen, grundlegend ändert.

Stellen Sie sich zum Beispiel eine Platte vor, bei der sich Verbindung A in den Vertiefungen 1-2-3, Verbindung B in den Vertiefungen 2-3-4 und Verbindung C in den Vertiefungen 3-4-5 befindet. In einem Test dieser Platte gegen ein gegebenes Ziel würde ein Treffer in den Vertiefungen 2, 3 und 4 anzeigen, dass Verbindung B das wahrscheinlichste Mittel ist, während gleichzeitig drei Messungen der Wirksamkeit von Verbindung B gegen das spezifizierte Ziel bereitgestellt werden. Kommerzielle Anwendungen dieses Ansatzes beinhalten Kombinationen, bei denen keine zwei Verbindungen jemals mehr als eine Vertiefung teilen, um die Möglichkeit (zweiter Ordnung) einer Interferenz zwischen Paaren von gescreenten Verbindungen zu verringern.

Jüngste Fortschritte

Automatisierung und Assay-Formate mit geringem Volumen wurden von Wissenschaftlern des NIH Chemical Genomics Center (NCGC) genutzt, um quantitatives HTS (qHTS) zu entwickeln, ein Paradigma zur pharmakologischen Profilierung großer chemischer Bibliotheken durch die Erzeugung vollständiger Konzentrations-Wirkungs-Beziehungen für jede Verbindung. Mit begleitender Kurvenanpassung und Cheminformatik-Software liefern die qHTS-Daten die halbe maximale effektive Konzentration (EC50), die maximale Reaktion, den Hill-Koeffizienten (nH) für die gesamte Bibliothek, was die Bewertung der naszierenden Struktur-Aktivitäts-Beziehungen (SAR) ermöglicht.

Im März 2010 wurde eine Forschungsarbeit veröffentlicht, die einen HTS-Prozess demonstriert, der ein 1.000-mal schnelleres Screening (100 Millionen Reaktionen in 10 Stunden) zu einem Millionstel der Kosten (mit dem 10 –7- fachen des Reagenzvolumens) als herkömmliche Techniken mit tropfenbasierter Mikrofluidik ermöglicht. Durch Öl abgeschiedene Flüssigkeitstropfen ersetzen die Mikrotiterplatten-Wells und ermöglichen die Analyse und Treffersortierung, während die Reagenzien durch die Kanäle fließen.

Im Jahr 2010 entwickelten die Forscher eine Siliziumfolie mit Linsen, die über Mikrofluidik-Arrays platziert werden können, um die Fluoreszenzmessung von 64 verschiedenen Ausgangskanälen gleichzeitig mit einer einzigen Kamera zu ermöglichen. Dieser Prozess kann 200.000 Tropfen pro Sekunde analysieren.

2013 haben Forscher einen Ansatz mit kleinen Molekülen aus Pflanzen veröffentlicht. Im Allgemeinen ist es wichtig, frühzeitig im Wirkstoffforschungsprozess qualitativ hochwertige Proof-of-Concept-Validierungen bereitzustellen. Hier sind Technologien, die die Identifizierung potenter, selektiver und bioverfügbarer chemischer Sonden ermöglichen, von entscheidendem Interesse, auch wenn die resultierenden Verbindungen für die Entwicklung zu einem pharmazeutischen Produkt weiter optimiert werden müssen. Als Beispiel für ein sehr anspruchsvolles Wirkstoffziel wurde der nukleäre Rezeptor RORα verwendet, ein Protein, das seit mehr als einem Jahrzehnt zur Identifizierung wirksamer und bioverfügbarer Agonisten eingesetzt wird. Treffer werden beim Screening-Schritt aufgrund der glockenförmigen Kurve bestätigt. Diese Methode ist der quantitativen HTS-Methode (gleichzeitiges Screening und Trefferbestätigung) sehr ähnlich, außer dass mit diesem Ansatz die Datenpunktzahl stark verringert wird und problemlos mehr als 100.000 biologisch relevante Verbindungen gescreent werden können.

Während die traditionelle HTS-Wirkstoffforschung gereinigte Proteine ​​oder intakte Zellen verwendet, wird eine sehr interessante neuere Entwicklung der Technologie mit der Verwendung intakter lebender Organismen wie dem Nematoden Caenorhabditis elegans und dem Zebrafisch ( Danio rerio ) in Verbindung gebracht.

In den Jahren 2016-2018 begannen die Plattenhersteller mit der Produktion von Spezialchemie, um die Massenproduktion von zellabweisenden Oberflächen mit extrem geringer Adhäsion zu ermöglichen, was die schnelle Entwicklung von HTS-fähigen Assays zur Entdeckung von Krebsmedikamenten in 3D-Geweben wie Organoiden und Sphäroiden erleichterte; ein physiologisch relevanteres Format.

Zunehmender Einsatz von HTS in der Wissenschaft für die biomedizinische Forschung

HTS ist eine relativ neue Innovation, die größtenteils durch moderne Fortschritte in der Robotik und Hochgeschwindigkeits-Computertechnologie möglich wurde. Da es immer noch ein hochspezialisiertes und teures Screening-Labor braucht, um einen HTS-Betrieb zu betreiben, wird eine kleine bis mittelgroße Forschungseinrichtung in vielen Fällen die Dienste einer bestehenden HTS-Einrichtung nutzen, anstatt eine eigene aufzubauen.

Es gibt einen Trend in der akademischen Welt, dass Universitäten ihre eigenen Wirkstoffforschungsunternehmen sind. Diese Einrichtungen, die sonst nur in der Industrie zu finden sind, finden sich nun zunehmend auch an Universitäten. UCLA beispielsweise verfügt über ein Open-Access-HTS-Labor für Molecular Screening Shared Resources (MSSR, UCLA), das täglich mehr als 100.000 Verbindungen routinemäßig untersuchen kann. Die Open-Access-Policy stellt sicher, dass Forscher aus der ganzen Welt diese Möglichkeit ohne langwierige Verhandlungen über geistiges Eigentum nutzen können. Mit einer Verbindungsbibliothek von über 200.000 kleinen Molekülen verfügt die MSSR über eines der größten Verbindungsdecks aller Universitäten an der Westküste. Darüber hinaus bietet das MSSR voll funktionsfähige Genomik- Fähigkeiten (genomweite siRNA, shRNA, cDNA und CRISPR), die die Bemühungen um kleine Moleküle ergänzen: Die funktionelle Genomik nutzt die HTS-Fähigkeiten, um genomweite Screens durchzuführen, die die Funktion jedes Gens im jeweiligen Kontext untersuchen indem man entweder jedes Gen ausschaltet oder es überexprimiert. Der parallele Zugang zu einem Hochdurchsatz-Screening für kleine Moleküle und einem Genom-Wide-Screen ermöglicht es Forschern, eine Zielidentifizierung und -validierung für eine bestimmte Krankheit oder die Bestimmung der Wirkungsweise eines kleinen Moleküls durchzuführen. Die genauesten Ergebnisse können durch die Verwendung von "arrayed" funktionellen Genomikbibliotheken erhalten werden, dh jede Bibliothek enthält ein einzelnes Konstrukt wie eine einzelne siRNA oder cDNA. Funktionelle Genomik wird typischerweise mit High-Content-Screening kombiniert , beispielsweise unter Verwendung von Epifluoreszenz-Mikroskopie oder Laser-Scanning-Zytometrie.

Die University of Illinois verfügt ebenso wie die University of Minnesota über eine Einrichtung für HTS. Das Life Sciences Institute der University of Michigan beherbergt die HTS-Anlage im Center for Chemical Genomics. Die Columbia University verfügt über eine gemeinsame HTS-Ressourcenanlage mit ~300.000 verschiedenen kleinen Molekülen und ~10.000 bekannten bioaktiven Verbindungen, die für biochemisches, zellbasiertes und NGS-basiertes Screening verfügbar sind. Die Rockefeller University verfügt über ein Open-Access- HTS-Ressourcenzentrum HTSRC (The Rockefeller University, HTSRC ), das eine Bibliothek mit über 380.000 Verbindungen bietet. Das High Throughput Analysis Laboratory der Northwestern University unterstützt die Identifizierung von Zielen, die Validierung, die Assay-Entwicklung und das Screening von Verbindungen. Das gemeinnützige Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute verfügt auch über eine langjährige HTS-Einrichtung im Conrad Prebys Center for Chemical Genomics, das Teil des MLPCN war. Das gemeinnützige Scripps Research Molecular Screening Center (SRMSC) dient auch nach der MLPCN-Ära der Wissenschaft über alle Institute hinweg. Die SRMSC-uHTS-Einrichtung unterhält eine der größten Bibliothekssammlungen im akademischen Bereich mit derzeit weit über 665.000 Einheiten kleiner Moleküle und überprüft routinemäßig die gesamte Sammlung oder Unterbibliotheken zur Unterstützung von Multi-PI-Zuschussinitiativen.

In den Vereinigten Staaten haben die National Institutes of Health (NIH) ein landesweites Konsortium von Screening-Zentren für kleine Moleküle geschaffen, um innovative chemische Werkzeuge für den Einsatz in der biologischen Forschung herzustellen. Das Molecular Libraries Probe Production Centers Network (MLPCN) führt HTS auf Assays durch, die von der Forschungsgemeinschaft bereitgestellt werden, gegen eine große Bibliothek kleiner Moleküle, die in einem zentralen Molekül-Repository aufbewahrt werden.

Siehe auch

Verweise

Weiterlesen

Externe Links