Scharzähler - Coulter counter
Ein Coulter-Zähler ist ein Gerät zum Zählen und Dimensionieren von Partikeln, die in Elektrolyten suspendiert sind . Das Coulter-Prinzip und der darauf basierende Coulter-Zähler ist der Handelsbegriff für die Technik, die als resistive Impulserfassung oder elektrische Zonenerfassung bekannt ist.
Ein typischer Coulter - Zähler hat einen oder mehrere Mikrokanäle , die zwei Kammern enthaltenden Elektrolyten trennen Lösungen . Da flüssigkeitshaltige Partikel oder Zellen durch jeden Mikrokanal gezogen werden, bewirkt jedes Partikel eine kurze Änderung des elektrischen Widerstands der Flüssigkeit. Der Zähler erkennt diese Änderungen des elektrischen Widerstands.
Scharprinzip
Das Coulter-Prinzip besagt, dass Partikel, die gleichzeitig mit einem elektrischen Strom durch eine Öffnung gezogen werden , eine Impedanzänderung erzeugen , die proportional zum Volumen der Partikel ist, die die Öffnung durchqueren. Dieser Impedanzimpuls stammt von der durch die Partikel verursachten Verdrängung des Elektrolyten. Das Coulter-Prinzip wurde nach seinem Erfinder Wallace H. Coulter benannt . Das Prinzip hat kommerziellen Erfolg in der medizinischen Industrie gefunden, insbesondere in der Hämatologie , wo es zur Zählung und Größe der verschiedenen Zellen, aus denen Vollblut besteht, angewendet werden kann.
Zellen als schlecht leitfähige Partikel verändern den effektiven Querschnitt des leitfähigen Mikrokanals. Wenn diese Partikel weniger leitfähig sind als das umgebende flüssige Medium, erhöht sich der elektrische Widerstand über den Kanal, wodurch der elektrische Strom, der durch den Kanal fließt, kurzzeitig abnimmt. Durch Überwachung solcher Stromimpulse kann die Anzahl der Partikel für ein gegebenes Flüssigkeitsvolumen gezählt werden. Die Größe der elektrischen Stromänderung hängt mit der Größe des Partikels zusammen, wodurch eine Partikelgrößenverteilung gemessen werden kann, die mit Mobilität, Oberflächenladung und Konzentration der Partikel korreliert werden kann .
Der Coulter-Zähler ist ein wesentlicher Bestandteil des modernen Krankenhauslabors . Seine Hauptfunktion ist die schnelle und genaue Analyse des kompletten Blutbildes (oft als CBC bezeichnet). Das CBC wird verwendet, um die Anzahl oder den Anteil der weißen und roten Blutkörperchen im Körper zu bestimmen. Zuvor umfasste dieses Verfahren das Anfertigen eines peripheren Blutausstrichs und das manuelle Zählen jeder Zellart unter einem Mikroskop , ein Vorgang, der normalerweise eine halbe Stunde dauerte.
Scharzähler haben eine Vielzahl von Anwendungen, darunter Farbe, Keramik, Glas, geschmolzene Metalle und Lebensmittelherstellung. Sie werden auch routinemäßig zur Qualitätskontrolle eingesetzt.
Ein Coulter-Zähler spielte eine wichtige Rolle bei der Entwicklung des allerersten Zellsortierers und war an den Anfängen der Entwicklung der Durchflusszytometrie beteiligt . Auch heute noch verwenden einige Durchflusszytometer das Coulter-Prinzip, um hochgenaue Informationen über Zellgröße und -zahl zu liefern.
Viele Forscher haben eine Vielzahl von Geräten nach dem Coulter-Prinzip entwickelt und von Experten begutachtete Veröffentlichungen mit Daten dieser Geräte erstellt. Einige dieser Geräte wurden auch kommerzialisiert. Alle Implementierungen des Coulter-Prinzips zeichnen sich durch Kompromisse zwischen Empfindlichkeit, Rauschabschirmung, Lösungsmittelkompatibilität, Messgeschwindigkeit, Probenvolumen, Dynamikbereich und Zuverlässigkeit der Geräteherstellung aus.
Entwicklung
Wallace H. Coulter entdeckte das Coulter-Prinzip in den späten 1940er Jahren, ein Patent wurde jedoch erst am 20. Oktober 1953 erteilt . Coulter wurde von den Atombomben beeinflusst, die auf Hiroshima und Nagasaki abgeworfen wurden . Diese Ereignisse motivierten Coulter, die Analyse von Blutzellen zu vereinfachen und zu verbessern, damit große Populationen schnell untersucht werden konnten, wie es im Falle eines Atomkriegs erforderlich wäre. Eine Teilfinanzierung des Projekts erfolgte durch einen Zuschuss des Office of Naval Research .
Coulter erhielt das US-Patent Nr. 2,656,508, Mittel zum Zählen von in einer Flüssigkeit suspendierten Partikeln . Das Coulter-Prinzip wird am häufigsten in einem Coulter-Zähler verwendet, einem Analysegerät, das für eine bestimmte Aufgabe wie das Zählen von Zellen entwickelt wurde. Es gibt jedoch zahlreiche andere Möglichkeiten, das Coulter-Prinzip umzusetzen. Einige davon wurden versucht, einige mit kommerziellem Erfolg und andere ausschließlich für die akademische Forschung. Die bisher kommerziell erfolgreichste Anwendung des Coulter-Prinzips liegt in der Hämatologie, wo es verwendet wird, um Informationen über die Blutzellen von Patienten zu gewinnen.
Das Coulter-Prinzip beruht darauf, dass Teilchen, die sich in einem elektrischen Feld bewegen, messbare Störungen in diesem Feld verursachen. Die Größe dieser Störungen ist proportional zur Größe der Partikel im Feld. Coulter identifizierte mehrere Anforderungen, die für die praktische Anwendung dieses Phänomens erforderlich sind. Zunächst sollten die Partikel in einer leitenden Flüssigkeit suspendiert werden. Als nächstes sollte das elektrische Feld physikalisch eingeschränkt werden, damit die Bewegung von Teilchen im Feld nachweisbare Änderungen des Stroms verursacht. Schließlich sollten die Partikel so verdünnt sein, dass jeweils nur ein Partikel die physikalische Verengung passiert, wodurch ein als Koinzidenz bezeichnetes Artefakt verhindert wird .
Während das Coulter-Prinzip in einer Vielzahl von Designs implementiert werden kann, gibt es zwei, die kommerziell am relevantesten sind. Diese umfassen ein Aperturformat und ein Fließzellenformat. Die obige Abbildung zeigt mehrere andere Geometrien, die Coulter patentiert hat.
Blendenformat
Das Blendenformat wird in den meisten handelsüblichen Coulter-Zählern verwendet. Dabei wird durch spezielle Fertigungsverfahren ein Loch definierter Größe in eine Steinscheibe (aus dem gleichen Material wie Steinlager in Uhren) eingebracht. Die resultierende Blende wird dann in die Wand eines Glasrohres eingebettet, wodurch ein sogenanntes Blendenrohr entsteht. Während des Gebrauchs wird die Blendenröhre in eine Flüssigkeit gelegt, so dass die Juwelenscheibe vollständig eingetaucht ist und sich die Röhre mit Flüssigkeit füllen kann. Elektroden sind sowohl innerhalb als auch außerhalb des Aperturrohrs positioniert, wodurch Strom durch die Apertur fließen kann. Mit einer Pumpe wird oben im Rohr ein Vakuum erzeugt, das die Flüssigkeit durch die Öffnung saugt. Zu analysierende Proben werden dann langsam zu der leitenden Flüssigkeit gegeben, die das Öffnungsrohr umgibt. Zu Beginn des Experiments wird das elektrische Feld eingeschaltet und die Pumpe beginnt, die verdünnte Suspension durch die Öffnung zu saugen. Die resultierenden Daten werden gesammelt, indem die elektrischen Impulse aufgezeichnet werden, die erzeugt werden, wenn die Partikel die Öffnung durchqueren.
Während der grundlegende physikalische Aufbau des Aperturformats in jedem Coulter-Zähler konsistent ist, variieren die Menge und Qualität der Daten stark in Abhängigkeit von der implementierten Signalverarbeitungsschaltung . Zum Beispiel können Verstärker mit niedrigeren Rauschschwellen und einem größeren Dynamikbereich die Empfindlichkeit des Systems erhöhen. In ähnlicher Weise liefern digitale Pulshöhenanalysatoren mit variablen Bin-Breiten im Gegensatz zu analogen Analysatoren mit festen Bins Daten mit viel höherer Auflösung. Darüber hinaus ermöglicht die Kombination eines Coulter-Zählers mit einem digitalen Computer die Erfassung vieler elektrischer Impulseigenschaften, während analoge Zähler typischerweise eine viel begrenztere Menge an Informationen über jeden Impuls speichern.
Fließzellenformat
Das Durchflusszellenformat wird am häufigsten in Hämatologieinstrumenten und manchmal in Durchflusszytometern implementiert. Bei diesem Format werden Elektroden an beiden Enden eines Strömungskanals eingebettet und das elektrische Feld wird durch den Kanal angelegt. Dieses Format hat gegenüber dem Blendenformat mehrere Vorteile. Diese Anordnung ermöglicht eine kontinuierliche Probenanalyse, während das Aperturformat ein Einzelchargenformat ist. Außerdem bietet sich die Verwendung einer Durchflusszelle an, einen Hüllfluss hinzuzufügen, der die Partikel in der Mitte des Durchflusskanals zentriert hält. Dadurch können gleichzeitig Messungen durchgeführt werden, beispielsweise das Antasten des Objekts mit einem Laser. Die Hauptnachteile des Durchflusszellenformats bestehen darin, dass es viel teurer in der Herstellung ist und typischerweise auf eine Kanalbreite festgelegt ist, während das Aperturformat eine Vielzahl von Aperturgrößen bietet.
Mikrofluidische Versionen
Das Coulter-Prinzip wurde auf Lab-on-a-Chip- Ansätze zur Partikeldetektion angewendet , wobei Mikrofluidik- Ansätze verwendet werden, die es ermöglichen, viel kleinere Poren herzustellen, als dies mit den Massenmethoden zur Herstellung herkömmlicher Coulter-Zähler leicht möglich wäre. Diese Ansätze, die unter dem Oberbegriff mikrofluidische resistive Pulsmessung bekannt sind , haben die Ausweitung des Coulter-Prinzips auf den tiefen Submikrometerbereich ermöglicht, was beispielsweise den direkten Nachweis von Viruspartikeln in Flüssigkeiten ermöglicht.
Experimentelle Überlegungen
Zufall
Anomale elektrische Impulse können erzeugt werden, wenn die Probenkonzentration so hoch ist, dass mehrere Partikel gleichzeitig in die Öffnung eintreten. Diese Situation wird als Zufall bezeichnet. Dies geschieht, weil es keine Möglichkeit gibt, sicherzustellen, dass ein einzelner großer Impuls das Ergebnis eines einzelnen großen Partikels oder mehrerer kleiner Partikel ist, die gleichzeitig in die Öffnung eintreten. Um diese Situation zu vermeiden, müssen die Proben ziemlich verdünnt sein.
Partikelpfad
Die Form des erzeugten elektrischen Impulses variiert mit dem Partikelweg durch die Öffnung. Schultern und andere Artefakte können auftreten, weil die elektrische Felddichte über den Durchmesser der Öffnung variiert. Diese Varianz resultiert sowohl aus der physikalischen Einschnürung des elektrischen Feldes als auch aus der Tatsache, dass die Flüssigkeitsgeschwindigkeit als Funktion der radialen Position in der Öffnung variiert. Im Durchflusszellenformat wird dieser Effekt minimiert, da der Hüllfluss sicherstellt, dass jedes Partikel einen nahezu identischen Weg durch die Durchflusszelle zurücklegt. Im Aperturformat können Signalverarbeitungsalgorithmen verwendet werden, um Artefakte zu korrigieren, die sich aus dem Partikelweg ergeben.
Leitfähige Partikel
Leitfähige Partikel sind ein häufiges Problem für Personen, die das Coulter-Prinzip berücksichtigen. Während dieses Thema interessante wissenschaftliche Fragen aufwirft, beeinflusst es in der Praxis selten die Ergebnisse eines Experiments. Dies liegt daran, dass der Leitfähigkeitsunterschied zwischen den meisten leitfähigen Materialien und Ionen in der Flüssigkeit (als Entladungspotential bezeichnet) so groß ist, dass die meisten leitfähigen Materialien in einem Coulter-Zähler als Isolatoren wirken. Die zum Durchbrechen dieser Potentialbarriere erforderliche Spannung wird als Durchbruchspannung bezeichnet. Bei hochleitfähigen Materialien, die ein Problem darstellen, sollte die während eines Coulter-Experiments verwendete Spannung unter das Durchbruchpotential (das empirisch bestimmt werden kann) reduziert werden.
Poröse Partikel
Das Coulter-Prinzip misst das Volumen eines Objekts, da die Störung im elektrischen Feld proportional zum aus der Öffnung verdrängten Elektrolytvolumen ist. Dies führt zu einiger Verwirrung bei denen, die optische Messungen von Mikroskopen oder anderen Systemen gewohnt sind, die nur zwei Dimensionen betrachten und auch die Grenzen eines Objekts zeigen. Das Coulter-Prinzip hingegen misst drei Dimensionen und das von einem Objekt verdrängte Volumen. Am nützlichsten ist es, an Schwämme zu denken; Auch wenn ein nasser Schwamm sehr groß erscheinen mag, verdrängt er deutlich weniger Flüssigkeit als ein massiver Ziegel mit den gleichen Abmessungen.
Gleichstrom und Wechselstrom
Der Coulter-Zähler, wie er von Wallace Coulter erfunden wurde, legt einen Gleichstrom (DC) an, um Partikel (Zellen) zu zählen, und erzeugt elektrische Impulse mit einer von der Größe der Zellen abhängigen Amplitude. Die Zellen können als elektrische Isolatoren modelliert werden, die von einer leitfähigen Flüssigkeit umgeben sind, die einen Teil des elektrischen Pfads blockieren und so den gemessenen Widerstand vorübergehend erhöhen . Dies ist das gängigste Messsystem nach dem Coulter-Prinzip.
Spätere Erfindungen waren in der Lage, die durch die Verwendung von Wechselstrom (AC) gewonnenen Informationen zu erweitern , um die komplexe elektrische Impedanz der Zellen und nicht nur ihre Größe zu untersuchen. Die Zelle kann dann ungefähr als isolierende Zellmembran modelliert werden , die das Zytoplasma der Zelle umgibt , das leitfähig ist. Die Dünne der Zellmembran erzeugt eine elektrische Kapazität zwischen dem Zytoplasma und dem die Zelle umgebenden Elektrolyten. Die elektrische Impedanz kann dann bei der einen oder anderen Wechselstromfrequenz gemessen werden. Bei niedrigen Frequenzen (deutlich unter 1 MHz ) ähnelt die Impedanz dem Gleichstromwiderstand. Höhere Frequenzen im MHz-Bereich untersuchen jedoch die Dicke der Zellmembran (die ihre Kapazität bestimmt). Bei viel höheren Frequenzen (deutlich über 10 MHz) sinkt die Impedanz der Membrankapazität jedoch bis zu dem Punkt, an dem der größere Beitrag zur gemessenen Impedanz vom Zytoplasma selbst stammt (die Membran ist im Wesentlichen "kurzgeschlossen"). Durch die Verwendung verschiedener Frequenzen wird das Gerät somit viel mehr als ein Zellzähler, der auch empfindlich auf die innere Struktur und Zusammensetzung der Zellen reagiert.
Hauptanwendungen
Hämatologie
Die erfolgreichste und wichtigste Anwendung des Coulter-Prinzips liegt in der Charakterisierung menschlicher Blutzellen. Die Technik wurde verwendet, um eine Vielzahl von Krankheiten zu diagnostizieren, und ist die Standardmethode zur Ermittlung der Anzahl der roten Blutkörperchen (RBCs) und der Anzahl der weißen Blutkörperchen (WBCs) sowie mehrerer anderer allgemeiner Parameter. In Kombination mit anderen Technologien wie Fluoreszenz-Tagging und Lichtstreuung kann das Coulter-Prinzip dazu beitragen, ein detailliertes Profil der Blutzellen von Patienten zu erstellen.
Zellenanzahl und -größe
Neben der klinischen Zählung von Blutzellen (Zelldurchmesser in der Regel 6–10 Mikrometer) hat sich das Coulter-Prinzip als zuverlässigstes Laborverfahren zur Zählung verschiedenster Zellen etabliert, von Bakterien (<1 Mikrometer Größe), Fett Zellen (etwa 400 Mikrometer), Pflanzenzellaggregate (> 1200 Mikrometer) und embryoide Körper von Stammzellen (etwa 900 Mikrometer).
Partikelcharakterisierung
Das Coulter-Prinzip hat sich für Anwendungen weit über zelluläre Studien hinaus bewährt. Dass es Partikel individuell vermisst, unabhängig von optischen Eigenschaften ist, extrem empfindlich und sehr reproduzierbar ist, spricht unterschiedlichste Bereiche an. Folglich wurde das Coulter-Prinzip auf die Nanoskala angepasst, um Techniken zur Charakterisierung von Nanopartikeln, die als mikrofluidische resistive Pulsmessung bekannt sind, sowie ein kommerzielles Unternehmen zu entwickeln, das eine Technik verkauft, die als abstimmbare resistive Pulsmessung oder TRPS bezeichnet wird. TRPS ermöglicht eine High-Fidelity-Analyse einer Vielzahl von Nanopartikeln, einschließlich funktionalisierter Nanopartikel zur Wirkstoffabgabe , virusähnlichen Partikeln (VLPs), Liposomen , Exosomen , polymeren Nanopartikeln und Mikrobläschen .
Siehe auch
Verweise
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Externe Links
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- US 2656508 Mittel zum Zählen von in einer Flüssigkeit suspendierten Partikeln , 20. Oktober 1953, Wallace H. Coulter
- "Dynamisch veränderbare Öffnungen im Nanometerbereich für die molekulare Sensorik"; Stephen J. Sowerby, Murray F. Broom, George B. Petersen; Sensors and Actuators B: Chemical Volume 123, Issue 1 (2007), Seiten 325–330