Chromatin-Immunpräzipitation - Chromatin immunoprecipitation

ChIP-Sequenzierungsworkflow

Die Chromatin-Immunpräzipitation ( ChIP ) ist eine experimentelle Methode der Immunpräzipitation , die verwendet wird, um die Interaktion zwischen Proteinen und DNA in der Zelle zu untersuchen. Es zielt darauf ab, festzustellen, ob bestimmte Proteine mit bestimmten genomischen Regionen assoziiert sind, wie Transkriptionsfaktoren auf Promotoren oder anderen DNA-Bindungsstellen , und möglicherweise Cistromes zu definieren . ChIP zielt auch darauf ab, die spezifische Stelle im Genom zu bestimmen, mit der verschiedene Histon- Modifikationen assoziiert sind, was das Ziel der Histon-Modifikatoren anzeigt.

Kurz gesagt, das konventionelle Verfahren ist wie folgt:

DNA und assoziierte Proteine auf Chromatin in lebenden Zellen oder Geweben werden vernetzt (dieser Schritt entfällt bei Native ChIP).
Die DNA-Protein-Komplexe (Chromatin-Protein) werden dann durch Beschallung oder Nuklease-Verdau in ~500 bp DNA-Fragmente geschert .
Vernetzte DNA-Fragmente, die mit dem/den interessierenden Protein(en) assoziiert sind, werden unter Verwendung eines geeigneten proteinspezifischen Antikörpers selektiv aus den Zelltrümmern immunpräzipitiert.
Die zugehörigen DNA-Fragmente werden gereinigt und ihre Sequenz bestimmt. Die Anreicherung spezifischer DNA-Sequenzen stellt Regionen auf dem Genom dar, mit denen das interessierende Protein in vivo assoziiert ist .

Typische ChIP

Es gibt hauptsächlich zwei Arten von ChIP, die sich hauptsächlich in der Ausgangschromatinpräparation unterscheiden. Die erste verwendet reversibel vernetztes Chromatin, das durch Beschallung geschert wird und als vernetztes ChIP (XChIP) bezeichnet wird. Natives ChIP (NChIP) verwendet natives Chromatin, das durch Mikrokokken- Nuklease- Verdau geschert wird .

Vernetztes ChIP (XChIP)

Cross-linked ChIP eignet sich hauptsächlich zur Kartierung des DNA-Targets von Transkriptionsfaktoren oder anderen Chromatin-assoziierten Proteinen und verwendet reversibel vernetztes Chromatin als Ausgangsmaterial. Das Mittel zur reversiblen Vernetzung könnte Formaldehyd oder UV-Licht sein . Dann wird das vernetzte Chromatin normalerweise durch Beschallung geschert, wodurch Fragmente von 300 - 1000 Basenpaaren (bp) Länge bereitgestellt werden . Zur Scherung des Chromatins wurde eine milde Formaldehyd-Vernetzung gefolgt von einem Nuklease-Verdau verwendet. Für ChIP-Assays haben sich Chromatinfragmente von 400-500bp als geeignet erwiesen, da sie zwei bis drei Nukleosomen abdecken .

Zelltrümmer im gescherten Lysat werden dann durch Sedimentation beseitigt und Protein-DNA-Komplexe werden selektiv mit spezifischen Antikörpern gegen das/die interessierende(n) Protein(e) immunpräzipitiert . Die Antikörper werden üblicherweise an Agarose , Sepharose oder magnetische Kügelchen gekoppelt . Alternativ können Chromatin-Antikörper-Komplexe selektiv zurückgehalten und durch inerte Polymerscheiben eluiert werden. Die immunpräzipitierten Komplexe (dh der Bead-Antikörper-Protein-Ziel-DNA-Sequenzkomplex) werden dann gesammelt und gewaschen, um unspezifisch gebundenes Chromatin zu entfernen, die Protein-DNA -Vernetzung wird rückgängig gemacht und Proteine werden durch Verdau mit Proteinase K entfernt . Anstelle von Antikörpern gegen das interessierende native Protein kann eine Epitop- markierte Version des interessierenden Proteins oder eine in vivo- Biotinylierung verwendet werden.

Die mit dem Komplex assoziierte DNA wird dann gereinigt und identifiziert durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR), Microarrays ( ChIP-on-Chip ), molekulare Klonierung und Sequenzierung oder direkte Hochdurchsatz-Sequenzierung ( ChIP-Seq ).

Native ChIP (NChIP)

Natives ChIP eignet sich hauptsächlich zur Kartierung des DNA-Ziels von Histon- Modifikatoren. Als Ausgangschromatin wird im Allgemeinen natives Chromatin verwendet. Da Histone sich um die DNA wickeln, um Nukleosomen zu bilden, sind sie auf natürliche Weise verbunden. Dann wird das Chromatin durch Mikrokokken-Nuklease-Verdau abgeschert, der die DNA auf der Länge des Linkers schneidet, Nukleosomen intakt lässt und DNA-Fragmente von einem Nukleosom (200 bp) bis fünf Nukleosomen (1000 bp) Länge liefert. Danach werden XChIP-ähnliche Verfahren verwendet, um die Zelltrümmer zu beseitigen, das interessierende Protein immunpräzipitieren, das Protein aus dem immunpräzipitierten Komplex zu entfernen und die komplex-assoziierte DNA zu reinigen und zu analysieren.

Vergleich von XChIP und NChIP

Der Hauptvorteil von NChIP ist die Antikörperspezifität . Es ist wichtig zu beachten, dass die meisten Antikörper gegen modifizierte Histone gegen unfixierte, synthetische Peptidantigene erzeugt werden und dass die Epitope, die sie im XChIP erkennen müssen, durch die Formaldehyd -Vernetzung zerstört oder zerstört werden können , insbesondere da die Vernetzungen wahrscheinlich beinhalten Lysin- e-Aminogruppen an den N-Terminen, wodurch die Epitope zerstört werden. Dies erklärt wahrscheinlich die durchweg niedrige Effizienz von XChIP-Protokollen im Vergleich zu NChIP.

XChIP und NChIP haben jedoch unterschiedliche Ziele und Vorteile im Verhältnis zueinander. XChIP dient zur Kartierung von Zielstellen von Transkriptionsfaktoren und anderen Chromatin-assoziierten Proteinen; NChIP dient zur Kartierung von Zielstellen von Histon-Modifikatoren (siehe Tabelle 1).

Tabelle 1 Vor- und Nachteile von NChIP und XChIP

	XChIP	NChIP
Vorteile	Geeignet für Transkriptionsfaktoren oder andere schwach bindende Chromatin-assoziierte Proteine. Anwendbar auf alle Organismen, bei denen natives Protein schwer herzustellen ist	Testbare Antikörperspezifität Bessere Antikörperspezifität als natürlich intaktes Zielprotein Bessere Effizienz der Chromatin- und Proteingewinnung durch bessere Antikörperspezifität
Nachteile	Ineffiziente Chromatin-Wiedergewinnung aufgrund von Epitop-Unterbrechung des Antikörper-Zielproteins Kann aufgrund der Fixierung transienter Proteine an Chromatin zu falsch positiven Ergebnissen führen. Breiter Bereich der Chromatin-Scherungsgröße durch zufälligen Schnitt durch Beschallung.	Normalerweise nicht für Nicht-Histon-Proteine geeignet Nukleosomen können sich während der Verdauung neu anordnen

Geschichte und neue ChIP-Methoden

1984 verwendeten John T. Lis und David Gilmour, zu der Zeit ein Doktorand im Lis-Labor, UV-Bestrahlung, ein Protein-Nukleinsäure-Vernetzungsmittel der Länge Null, um Proteine, die in lebenden Bakterienzellen an DNA gebunden sind, kovalent zu vernetzen . Nach Lyse vernetzter Zellen und Immunpräzipitation von bakterieller RNA-Polymerase wurde DNA, die mit angereicherter RNA-Polymerase assoziiert war, mit Sonden hybridisiert, die verschiedenen Regionen bekannter Gene entsprachen, um die in vivo-Verteilung und Dichte der RNA-Polymerase an diesen Genen zu bestimmen. Ein Jahr später verwendeten sie dieselbe Methodik, um die Verteilung der eukaryontischen RNA-Polymerase II auf Hitzeschockgenen von Fruchtfliegen zu untersuchen. Diese Berichte gelten als bahnbrechende Studien auf dem Gebiet der Chromatin-Immunpräzipitation. XChIP wurde von Alexander Varshavsky und Mitarbeitern weiter modifiziert und entwickelt , die die Verteilung von Histon H4 auf Hitzeschockgenen mittels Formaldehyd-Vernetzung untersuchten. Diese Technik wurde danach umfassend weiterentwickelt und verfeinert. Der NChIP-Ansatz wurde zuerst von Hebbes et al ., 1988, beschrieben und ebenfalls schnell entwickelt und verfeinert. Der typische ChIP-Test dauert normalerweise 4–5 Tage und erfordert mindestens 10 ⁶ ~ 10 ⁷ Zellen. Jetzt könnten neue Techniken auf ChIP mit nur 100~1000 Zellen erreicht und innerhalb eines Tages abgeschlossen werden.

Kügelchenfreies ChIP : Dieses neuartige ChIP-Verfahren verwendet Scheiben aus inertem, porösem Polymer, die entweder mit Protein A oder G in Spinsäulen oder Mikrotiterplatten funktionalisiert sind. Der Chromatin-Antikörper-Komplex wird selektiv von der Scheibe zurückgehalten und eluiert, um angereicherte DNA für nachgelagerte Anwendungen wie qPCR und Sequenzierung zu erhalten. Die poröse Umgebung wurde speziell entwickelt, um die Einfangeffizienz zu maximieren und unspezifische Bindungen zu reduzieren. Durch weniger manuelle Handhabung und optimierte Protokolle kann ChIP in 5 Stunden durchgeführt werden.
Carrier ChIP (CChIP): Bei diesem Ansatz könnten nur 100 Zellen verwendet werden, indem Drosophila- Zellen als Trägerchromatin hinzugefügt werden, um den Verlust zu reduzieren und die Ausfällung des Zielchromatins zu erleichtern. Es erfordert jedoch hochspezifische Primer zum Nachweis des Chromatins der Zielzelle vor dem Hintergrund des Fremdträgerchromatins, und es dauert zwei bis drei Tage.
Fast ChIP (qChIP): Der schnelle ChIP-Assay verkürzt die Zeit durch die Verkürzung von zwei Schritten in einem typischen ChIP-Assay: (i) ein Ultraschallbad beschleunigt die Geschwindigkeit der Antikörperbindung an Zielproteine – und verkürzt dadurch die Immunpräzipitationszeit (ii) ein Harz- basierte (Chelex-100) DNA-Isolierungsverfahren verkürzt die Zeit der Crosslink- Umkehrung und DNA-Isolierung. Das schnelle Protokoll ist jedoch nur für große Zellproben (im Bereich von 10 ⁶ ~ 10 ⁷ ) geeignet . Bis zu 24 gescherte Chromatinproben können in 5 Stunden zu PCR-bereiter DNA verarbeitet werden, wodurch mehrere Chromatinfaktoren gleichzeitig untersucht und/oder genomische Ereignisse über mehrere Zeitpunkte betrachtet werden können.

Schnelles und quantitatives ChIP (Q ² ChIP): Der Assay verwendet 100.000 Zellen als Ausgangsmaterial und ist für bis zu 1.000 Histon-ChIPs oder 100 Transkriptionsfaktor-ChIPs geeignet. So können viele Chromatinproben parallel präpariert und gelagert werden und Q ² ChIP an einem Tag durchgeführt werden.
MicroChIP (µChIP): Chromatin wird normalerweise aus 1.000 Zellen hergestellt und bis zu 8 ChIPs können ohne Träger parallel durchgeführt werden. Der Assay kann auch mit 100 Zellen beginnen, ist aber nur für einen ChIP geeignet. Es kann auch klein (1 mm verwenden ³ ) Gewebebiopsien und Mikrochip kann innerhalb eines Tages erfolgen.
Matrix ChIP : Dies ist ein Mikrotiterplatten- basierter ChIP-Assay mit erhöhtem Durchsatz und vereinfachtem Verfahren. Alle Schritte werden in Mikrotiterplatten-Wells ohne Probentransfer durchgeführt, was ein Automatisierungspotenzial ermöglicht. Es ermöglicht 96 ChIP-Assays für Histon und verschiedene DNA-gebundene Proteine an einem einzigen Tag.
Pathologie-ChIP (PAT-ChIP): Diese Technik ermöglicht die ChIP aus pathologischen Formalin-fixierten und Paraffin-eingebetteten Geweben und damit die Nutzung von (auch mehrjährigen) Pathologiearchiven für epigenetische Analysen und die Identifizierung von Kandidaten für epigenetische Biomarker oder Ziele.

ChIP wird auch für genomweite Analysen durch Kombination mit der Microarray-Technologie ( ChIP-on-Chip ) oder der DNA-Sequenzierungstechnologie der zweiten Generation ( Chip-Sequencing ) verwendet. ChIP kann auch mit Paired-End-Tags- Sequenzierung in der Chromatin-Interaktionsanalyse mit Paired-End-Tag-Sequenzierung (ChIA-PET) kombiniert werden, einer Technik, die für die groß angelegte De-novo-Analyse von Chromatinstrukturen höherer Ordnung entwickelt wurde.

Einschränkungen

Assays im großen Maßstab mit ChIP sind mit intakten Modellorganismen eine Herausforderung. Dies liegt daran, dass für jeden TF Antikörper erzeugt werden müssen oder alternativ transgene Modellorganismen produziert werden müssen, die Epitop-markierte TFs exprimieren.
Forscher, die unterschiedliche Genexpressionsmuster in kleinen Organismen untersuchen, sehen sich ebenfalls mit Problemen konfrontiert, da Gene in geringen Mengen in einer kleinen Anzahl von Zellen in einem engen Zeitfenster exprimiert werden.
ChIP-Experimente können nicht zwischen verschiedenen TF-Isoformen ( Proteinisoform ) unterscheiden.

Siehe auch

ChIP-exo , eine Technik, die dem ChIP-Prozess eine Exonuklease-Behandlung hinzufügt, um eine Auflösung von Bindungsstellen bis zu einem einzigen Basenpaar zu erreichen
ChIP-on-Chip , kombiniert ChIP mit Microarray-Technologie
DamID , eine alternative Location-Mapping-Technik, die keine spezifischen Antikörper erfordert
RIP-Chip , eine ähnliche Technik zur Analyse von RNA-Protein-Interaktionen

Verweise

Externe Links

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