Blebbistatin - Blebbistatin
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| Namen | |
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IUPAC-Name
3a-Hydroxy-6-methyl-1-phenyl-2,3-dihydropyrrolo[2,3- b ] chinolin -4-on
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| Andere Namen
( S )-Blebbistatin, (-)-Blebbistatin
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| Bezeichner | |
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3D-Modell ( JSmol )
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PubChem- CID
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| UNII | |
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| Eigenschaften | |
| C 18 H 16 N 2 O 2 | |
| Molmasse | 292.338 g·mol -1 |
| Aussehen | Gelber Feststoff |
| 10 μM | |
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Sofern nicht anders angegeben, beziehen sich die Daten auf Materialien im Standardzustand (bei 25 °C [77 °F], 100 kPa). |
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| Infobox-Referenzen | |
Blebbistatin ist ein Myosin- Inhibitor, der hauptsächlich für Myosin II spezifisch ist. Es wird in der Forschung häufig zur Hemmung von Herzmuskel- Myosin, Nicht-Muskel-Myosin II und Skelettmuskel- Myosin verwendet. Blebbistatin war besonders nützlich bei der optischen Kartierung des Herzens, und seine kürzliche Verwendung in Herzmuskelzellkulturen hat die Zellüberlebenszeit verbessert. Seine nachteiligen Eigenschaften, zB seine Zytotoxizität und Blaulicht-Instabilität oder die geringe Löslichkeit in Wasser, machen seine Anwendung jedoch oft zu einer Herausforderung. Kürzlich wurde seine Anwendbarkeit durch chemisches Design verbessert und seine Derivate überwinden die Beschränkungen von Blebbistatin. ZB para-nitroblebbistatin und para-aminoblebbistatin photostabil sind, und sie sind weder zytotoxische noch fluoreszierend.
Wirkungsweise und biologische Effekte
Blebbistatin hemmt die Myosin-ATPase-Aktivität und auf diese Weise die auf Aktomyosin basierende Motilität . Es bindet auf halbem Weg zwischen der Nukleotid-Bindungstasche und der Aktin-Bindungsspalte von Myosin, überwiegend in einer Aktin-abgelösten Konformation. Diese Art der Hemmung entspannt die Actomyosin- Myofilamente und führt zu mehreren biologischen Effekten.
Blebbistatin hemmt die Bildung von Blasen in Melanomzellkulturen, daher der Name. Auf zellulärer Ebene hemmt Blebbistatin auch die Zytokinese und kann auch die mitotische Spindelbildung stören . Die Migration von Zellen kann abhängig von anderen Bedingungen entweder verstärkt oder gehemmt werden. In Neuronen wurde festgestellt, dass Blebistatin das Neuritenwachstum fördert . Auf Organebene stoppt Blebbistatin die Kontraktion der Skelettmuskulatur oder des Herzmuskels . Es wurde auch festgestellt, dass Blebbistatin den superentspannten Zustand in den Myofilamenten stabilisiert, wo Myosinköpfe in einer helikalen Ordnung angeordnet sind und miteinander, aber nicht mit Aktin interagieren.
Nachteilige Eigenschaften
Eine Reihe von physikalisch-chemischen Mängeln behindern die Verwendung von Blebbistatin als chemisches Werkzeug in bestimmten Anwendungen.
Fotoinstabilität
Bei Beleuchtung mit blauem Licht wird Blebbistatin aufgrund von Veränderungen in der Struktur der Verbindung, die von der Bildung von ROS . begleitet werden , inaktiv und phototoxisch
Fluoreszenz
Blebbistatin ist ein relativ starkes Fluorophor . In Wasser gelöst absorbiert es bei 420 nm und emittiert bei 490 nm, jedoch in DMSO oder wenn es durch Herzgewebe perfundiert wird, absorbiert es etwa 430 nm und emittiert etwa 560 nm, daher stört seine Fluoreszenz bei hohen Konzentrationen die GFP- Bildgebung oder FRET- Experimente. Die Verringerung der Konzentration von Blebbistatin auf 6,25 uM ermöglicht eine FRET- Bildgebung in isolierten Herzmuskelzellen von erwachsenen Mäusen .
Zytotoxizität
Eine Langzeitinkubation mit Blebbistatin führt zu Zellschäden und Zytotoxizität, die unabhängig von der Myosin-hemmenden Wirkung sind.
Diese Photoinstabilität, Phototoxizität und Fluoreszenz machen die In-vivo-Bildgebung von mit Blebbistatin behandelten Proben unmöglich.
Myosin-Spezifität
Blebbistatin ist ein potenter Inhibitor von nicht-Muskel-Myosin IIA und IIB, Herz-Myosin, Skelett-Myosin und glatter Muskulatur, hemmt jedoch nicht Myosin I, V und X. Die folgende Tabelle fasst die IC50- Daten von Blebbistatin für verschiedene Myosin-Isoformen zusammen.
| Spezies | Myosin-Isoform oder Muskeltyp | Assay-Typ | IC50 |
|---|---|---|---|
| Dictyostelium discoideum | Motordomäne von Myosin II | basale ATPase | 2,96 ± 0,45 µM, 4,4 ± 0,3 µM, 4,9 µM |
| Dictyostelium discoideum | Motordomäne von Myosin II | Aktin aktivierte ATPase | 3,9 ± 0,3 μM |
| Kaninchen | Skelettmuskel II | basale ATPase | 0,50 μM, 0,3 ± 0,03 μM, 0,41 ± 0,03 μM |
| Kaninchen | Skelettmuskel II | Aktin aktivierte ATPase | 0,11 ± 0,009 μM |
| Schweineartig | b-Herzmuskel | basale ATPase | 1,2 μM |
| Jakobsmuschel | gestreifter Muskel | basale ATPase | 2,3 μM |
| Menschlich | Nichtmuskel IIA | basale ATPase | 5,1 μM |
| Hähnchen | Nichtmuskel IIB | basale ATPase | 1,8 μM |
| Menschlich | Nichtmuskel IIA | Aktin aktivierte ATPase | 3,58 μM |
| Menschlich | Nichtmuskel IIB | Aktin aktivierte ATPase | 2,30 μM |
| Maus | Nichtmuskel IIC | Aktin aktivierte ATPase | 1,57 μM |
| Truthahn | glatte Muskelzellen | basale ATPase | 79,6 μM |
| Akanthamöben | Myosin II | basale ATPase | 83 μM |
| Ratte | Myosin 1B | basale ATPase | >150 μM |
| Akanthamöben | Myosin IC | basale ATPase | >150 μM |
| Maus | Myosin V | basale ATPase | >150 μM |
| Rinder | Myosin X | basale ATPase | >150 μM |
| glatte Muskulatur Myosin IIA schwere Kette | Aktin aktivierte ATPase | 3 μM | |
| glatte Muskulatur Myosin IIB schwere Kette | Aktin aktivierte ATPase | 3 μM | |
| Kaninchen | Oberschenkel-, Nieren- und Saphenusarterie | tonische Kontraktion | 5 μM |
| Hähnchen | Muskelmagen | Kontraktion | 20 μM |
| Hähnchen | Muskelmagen glatte Muskulatur HMM | basale ATPase | 15 ± 0,6 μM |
| Hähnchen | Muskelmagen glatte Muskulatur | Aktin aktivierte ATPase | 6,47 μM |
| Ratte | Blase | Kontraktion | 100 % Hemmung bei 15 μM |
| Maus | intakter stimulierter Herzpapillarmuskel | Kontraktion | 1,3 μM |
| Maus | Ca 2+ -aktivierter, permeabilisierter Herzpapillarmuskel | Kontraktion | 2,8 μM |
| Ratte | enthäutete Herztrabekel | Ca 2+ aktivierte Kraft | 0,38 ± 0,03 μM |
| Ratte | native demembranierte rechtsventrikuläre Trabekel | isometrische Kraftentwicklung | 3,17 ± 0,43 μM |
| Drosophila | Nicht-Muskel-Myosin-2 | Aktin aktivierte ATPase | keine Hemmung |
| Drosophila | Nicht-Muskel-Myosin-2 M466I-Mutation | Aktin aktivierte ATPase | 36,3 ± 4,1 μM |
| Drosophila | Herzschläuche | Herzwandbewegung | 100 μM führten zu einer vollständigen Hemmung |
| Seestern | Nicht-Muskel-Myosin-2 | Zytokinese der Eizelle | wirksam bei 300 μM |
| C. elegans | Nicht-Muskel-Myosin-2 | Aktomyosin-Kolokalisationsmikroskopie | wirksam bei 100 μM |
| C. elegans | Nicht-Muskel-Myosin-2 | ventrales Gehäuse | wirksam bei 100 μM |
| Podocoryna carnea ( Nesseltier ) | Nicht-Muskel-Myosin-2 | Stolonspitzenpulsationen und gastrovaskulärer Fluss | wirksam bei 255 μM |
Derivate
Die Hauptziele der Struktur-Wirkungs-Beziehungs-Arbeiten am Blebbistatin-Gerüst sind die Verbesserung der physikalisch-chemischen Eigenschaften und der ATPase-Hemmwirkung als chemische oder pharmakologische Werkzeuge. Es wurden mehrere Analoga mit überlegenen Eigenschaften entwickelt und Richtlinien für ihre optimale Anwendung beschrieben.
para -Nitroblebbistatin
Ein nicht fluoreszierendes, nicht phototoxisches, nicht zytotoxisches Derivat, das 2014 entwickelt wurde. Seine Myosin-hemmenden Eigenschaften ähneln denen von Blebbistatin (für Skelettmuskelmyosin von Kaninchen S1 IC50 = 0,4 µM, für Dictyostelium discoideum Myosin II-Motordomäne IC50 = 2,3 µM , für humanes β-Herz-Myosin-Subfragment 1 IC50 = 13 µM, für schweres Meromyosin-Fragment von Hühnerskelettmuskel-Myosin IC50 = 0,4 µM). Es wurde erfolgreich in Fluoreszenz-Imaging-Experimenten mit Myosin IIA-GFP verwendet, das lebende dendritische Zellen exprimiert
para -Aminoblebstatatin
Ein wasserlösliches Blebistatin-Derivat, das 2016 entwickelt wurde, seine hohe Wasserlöslichkeit (~400 uM) ermöglicht In-vivo-Forschungsanwendungen. Para-Aminoblebbistatin ist ein etwas schwächerer Myosin-Inhibitor als Blebbistatin (für Kaninchen-Skelettmuskel-Myosin S1 IC50 = 1,3 µM, für Dictyostelium discoideum Myosin II-Motordomäne IC50 = 6,6 µM mit nur 90 % maximaler Hemmung), es ist nicht fluoreszierend, photostabil, weder zytotoxisch noch phototoxisch.
Azidoblebbistatin
Ein photoreaktiver Myosin-Inhibitor, der 2012 entwickelt wurde. Eine dauerhafte Hemmung von Myosin kann durch kovalente Vernetzung des Inhibitors Azidoblebbistatin mit seinem Ziel durch Photoaffinitätsmarkierung (PAL) erreicht werden. Kurz gesagt bildet die Arylazid-Einheit in Azidoblebbistatin bei UV-Bestrahlung ein reaktives Nitren. Diese Reaktion wird genutzt, um eine kovalente Bindung zwischen dem Inhibitor und Myosin zu bilden.
Azidoblebbistatin ist auch gegenüber Zwei-Photonen-Bestrahlung empfindlich, dh die kovalente Vernetzung kann auch durch ein Zwei-Photonen-Anregungsmikroskop erzeugt werden , daher ist Azidoblebbistatin für das molekulare Tätowieren geeignet.
( S )-Nitroblebbistatin
Dieses Derivat wurde 2005 entwickelt, um die Photostabilität zu erhöhen und die Fluoreszenz von Blebbistatin zu verringern. (S)-Nitroblebbistatin ist in der Tat gegenüber längerer Bestrahlung bei 450-490 nm stabil und wurde erfolgreich in der fluoreszierenden Bildgebung lebender Zellen verwendet. Jedoch nahm seine Affinität zu Myosin mit der Nitrosubstitution signifikant ab (für Nicht-Muskel-Myosin IIA, IC 50 = 27 μM). In vielen Fällen ist es aufgrund der geringen Löslichkeit nicht möglich, mit (S)-Nitroblebbistatin eine vollständige Myosinhemmung zu erreichen. Es ist effektiv für die FRET-Bildgebung von isolierten Herzmuskelzellen von adulten Mäusen.
(+)-Blebbistatin
(+)-Blebbistatin (oder ( R )-Blebistatin) ist das inaktive Enantiomer von Blebbistatin, das die ATPase-Aktivität um maximal 10 % hemmt. In der Forschung ist es eine nützliche Verbindung zur Kontrollbehandlung, um die nicht mit Myosin in Zusammenhang stehenden toxischen Wirkungen von Blebbistatin zu überprüfen.
Andere Derivate
Das Blebbistatin-Gerüst wurde auf verschiedene Weise modifiziert, um die Myosin-Isoform-Spezifität zu optimieren oder die inhibitorischen Eigenschaften zu verbessern und die Struktur-Wirkungs-Beziehung abzubilden . Zu den wichtigsten Optimierungsschritten zählen die Arbeiten von Lucas-Lopez et al. von 2008 und die Arbeiten von Verhasselt et al. ab 2017. Letztere Studien beinhalten auch Modifikationen der A- und C-Ringe des Gerüsts.
para -Chloroblebistatin
Ein photostabiles, nicht fluoreszierendes, phototoxisches Derivat. Seine Fluoreszenz beträgt weniger als 1 % der von Blebbistatin. Die Myosin-Hemmungseigenschaften sind denen von Blebbistatin ähnlich. Es ist sogar phototoxischer als Blebbistatin.